诱导多能干细胞iPSC向巨噬细胞分化的研究

2006年，Yamanaka等在小鼠成纤维细胞中同时导入Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4(简称OSKM)后获得了与胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)相似特性的干细胞，并将这些细胞命名为诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)。这也为曾经的体细胞核移植时核基因组恢复其分化前的功能状态(重编程)这一现象提供了分子基础。

2007年，Takahashi等将OSKM导入人皮肤成纤维细胞产生了人iPSCs，同期James Thomson等使用不同转录因子组合(Oct4，Sox2，Nanog，Lin28) 同样将体细胞重编程为iPSCs。随着研究的深入，越来越多的体细胞都可以被重编程为iPSCs，重编程的方法也随之增加。到目前为止，只有转录因子Oct3/4被认为是必不可少的，而Sox2、Klf4、c-Myc则被认为是可以替代的转录因子。与原代分离的多能干细胞相比，iPSCs的细胞来源丰富，操作简便，应用范围广，为许多疾病的研究与治疗提供了全新的思路和技术方法，目前已有使用iPSCs来模拟人体各类组织、器官和其他系统的发生发育发展过程及各类疾病模型。

基于iPSCs的疾病建模方法

iPSCs的来源及获取方法

自Yamanaka等将OSKM四种转录因子导入小鼠成纤维细胞中将其重编程为iPSCs后，不同体细胞诱导iPSCs的方法便相继出现。目前，已被证实可诱导为iPSCs的细胞种类不断增多，成纤维细胞、角蛋白细胞、大鼠眼细胞、小鼠和兔的肝脏与胃细胞、胰岛β细胞、神经祖细胞等均可以重编程为iPSCs。

2008年，通过优化重编程方法，获得了不需要c-Myc逆转录病毒的iPSCs。同期，Huangfu等仅使用Oct4和Sox2成功重编程得到iPSCs。人们进一步发现只有Oct4是重编程过程中所必需的转录因子，Oct4在ESCs的多能维持和成熟细胞重新编程至iPSCs中起着突出的作用。

2009年James A Thomson等使用非整合的表观载体完成了对人体细胞的重编程]，相比于整合型重编程方法，使用非整合重编程不需要基因组整合或外源重编程因子的持续表达，消除了人类iPSCs临床应用的一个障碍。随后越来越多可用于重编程的方法被研究出来，如使用仙台病毒、附加、mRNA转染和转座子等。之后，很多学者利用小分子进行体细胞的重编程，这种化学重编程避免了基因组的改变，降低了致瘤性，为iPSCs临床应用提供了更多的可能性，为人类获取iPSCs提供了新方法、新思路。

iPSCs应用现状

iPSCs广泛应用于构建人类疾病模型、发育模型与再生医学中，对分析病因、探究疾病治疗靶点和药物筛选具有重要意义。iPSCs在功能和发育方面更加类似于胚胎干细胞，理论上可以诱导成机体的各类细胞，且具有无限增殖的能力。因此，可以使用iPSCs及其衍生细胞来模拟身体组织、器官。如今，已经可以将iPSCs诱导为内皮细胞、神经元、自然杀伤细胞、生殖细胞、巨噬细胞等，为疾病模型的建立和分化机制的研究提供了平台。患者与供体ESCs之间的组织不兼容性以及人类ESCs相关的伦理问题是目前限制发展的严重阻碍，而iPSCs技术有望解决这些问题。巨噬细胞作为人体的第一道防线，利用iPSCs诱导分化为巨噬细胞为相关疾病建模及巨噬细胞相关机理研究提供了良好的基础。

巨噬细胞起源

1893年Élie Metchnikoff等在观察组织炎症和吞噬病原体时，首次发现了嗜中性粒细胞和巨噬细胞吞噬病原体的现象。因为其吞噬病原体的功能，后来的科学家将其归类于组织免疫细胞。1968年，Ralf van Furth和Zanvil Cohn共同定义了单核吞噬细胞系统，认为巨噬细胞是来源于骨髓干细胞起源的单核细胞(Monocytes)，具有很强的吞噬能力，且细胞核不分叶。单核吞噬细胞系统是当时巨噬细胞起源的主要模型。但是，最近的研究表明，巨噬细胞存在着不依赖造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs) 的起源方式，其中一类是在早期卵黄囊中经原位分化直接产生，并迁移到胚胎各处；另一类则由卵黄囊来源的红系髓系祖细胞(Yolk sac-derived myeloid- biased progenitors，YSMPs) 先形成单核细胞后分化为巨噬细胞，这类巨噬细胞具有自我更新能力，并且不依赖于单核细胞的分化，如肝脏(库佛氏细胞)、大脑(小胶质细胞)、表皮(朗格汉斯细胞) 和肺(肺泡巨噬细胞) 中的绝大多数组织驻留巨噬细胞(Tissue-resident macrophage，TRM)，是来自与HSCs不同的Tek细胞通路。然而，形成TRM的YSMPs的确切性质仍然存在争议，使巨噬细胞群体维持的机制也不明确。但这也为巨噬细胞起源阐明了新的途径，也为iPSCs诱导巨噬细胞提供了新的思路与方法。

巨噬细胞起源及相关标记模式图

巨噬细胞表型与功能

巨噬细胞具有极高的可塑性，可以从一种表型转换到另一种表型。巨噬细胞极化是一种特定的表型，并对每个特定组织中遇到的微环境刺激和信号作出功能性反应的过程。根据巨噬细胞的表型与功能，目前普遍认为巨噬细胞存在一系列连续的功能状态，而经典激活或促炎(M1) 型和交替激活或抗炎(M2) 型巨噬细胞是这一连续状态的两个极端。M1型巨噬细胞通常由Th1细胞因子(如IFN-γ和TNF-α)或细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导，并分泌较高水平的促炎细胞因子TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23和环氧合酶-2 (COX-2)，并专职提呈抗原，参与正向免疫应答，发挥免疫监视的功能；M2型巨噬细胞通常通过IL-4受体α (IL-4Rα) 激活STAT6，或通过IL-10受体(IL-10R) 激活STAT 3来促进其极化，有较弱抗原提呈能力，并通过分泌抑制性细胞因子IL-10或TGF-β等下调免疫应答，在免疫调节中发挥重要作用。因此，M1型巨噬细胞有较强的抗微生物和抗肿瘤活性，介导活性氧(Reactive oxygen species，ROS) 所致的组织损伤，限制组织再生和伤口愈合。为了防止这种组织损伤，M2型巨噬细胞通过较强的吞噬能力，清除碎片和凋亡的细胞，促进组织修复和伤口愈合，从而抑制慢性炎症反应。

巨噬细胞是先天免疫系统的关键组成部分，在发育过程中分布在不同的组织和器官中，并通过局部增殖和稳态募集而终生维持。这些组织驻留巨噬细胞群体在各种组织特异性的生理和病理过程中起着核心作用。巨噬细胞还提供了抵御入侵病原体的一道防线，协调先天免疫反应，并激活适应性免疫应答。而且在大多数癌症中，巨噬细胞与肿瘤浸润和预后不良相关，并会导致化疗耐药性，这使得肿瘤相关巨噬细胞无论是通过肿瘤消融还是从亲肿瘤状态向抗肿瘤状态的再分化，都是人类抗癌治疗的良好靶点。因此，在生物学以及人类疾病的背景下，巨噬细胞的功能及表征是许多研究者的主要重点。而实验性人类巨噬细胞主要有两个来源：肿瘤衍生细胞系，如U937、THP-1细胞等，或原代细胞，如外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)、单核细胞源性巨噬细胞(Human-monocyte derived macrophages，HMDM)。前者虽具有无限增殖的能力，但核型异常、表型不成熟，不能进行特定基因型的研究。后者是一种应用广泛的巨噬细胞功能实验模型，虽然相对容易获得，但HMDM是终末分化的，不能进行自我更新，缺乏增殖能力，且较难对其进行基因编辑。利用iPSCs诱导产生的巨噬细胞(Induced pluripotent stem cell-derived macrophages，IPSDM) 可以解决巨噬细胞的获取问题，并可利用先前构建的基因型特异性的iPSCs来衍生出核型正常和基因型稳定的巨噬细胞。这种方法为研究巨噬细胞特定功能、免疫应答机制、活化和极化分子及巨噬细胞相关疾病或肿瘤治疗提供了良好的工具。

诱导多能干细胞向巨噬细胞分化的方法

目前巨噬细胞研究主要通过使用血液单核细胞衍生的巨噬细胞，这些不仅需要来自献血者大量的血液，并且相对难以进行基因编辑。因此，IPSDM为人类巨噬细胞研究提供了一个有力的解决方法。通过对小鼠和人iPSCs产生的畸胎瘤进行分析，证实了iPSCs具有分化为三胚层不同细胞的潜力。此外，iPSCs来源的细胞能够嵌合到多种组织、器官甚至生殖系。小鼠和人类iPSCs已被广泛用于研究造血和免疫系统的发展。虽然并非所有细胞都可以以相同的效率获得，但免疫细胞，如巨噬细胞和自然杀伤细胞等，可以较便捷地利用iPSCs获得，并利用其研发新的细胞疗法。iPSCs衍生的巨噬细胞也可以作为癌症免疫治疗的新方法以及修复或再生患病/受损组织和器官的新策略。

iPSCs诱导分化巨噬细胞体外模型(GM-CSF：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；M-CSF：巨噬细胞集落刺激因子；IL：白介素；BMP4：骨形态发生蛋白4；Activin A：激活素A；VEGF：血管内皮生长因子；bFGF：成纤维细胞生长因子；SCF：干细胞因子；TPO：血小板生成素；IFN：干扰素；TGF：转化生长因子；TNF：肿瘤坏死因子)

iPSCs的相关问题已经经过了10多年的研究，取得了不错的研究进展，与胚胎干细胞相比，iPSCs解决了免疫排斥问题和伦理道德问题，为相关领域的研究开辟了新方向、新思路。

巨噬细胞作为人体内重要的免疫细胞，iPSCs向巨噬细胞分化为研究者获取巨噬细胞并在体外培养提供了一个便捷、可靠的来源，为研究巨噬细胞发育规律建立了良好的模型，且对IPSDM进行基因修饰可以针对一些免疫相关疾病提供基因分析工具，但目前对其相关分化机制的研究还十分有限，探究其分化机制为人类免疫系统的研究提供了很好的借鉴意义，且过程可视化。

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北京北联世纪干细胞生物科技是一所集临床、科研、国际学术交流为一体的全球生命科学研究公司，技术源头为美国圣地亚哥Biocentrium公司，公司致力于再生医学新技术的基础研究与临床应用转化，并将iPSC诱导多能干细胞培养技术平移到国内，同时与国内多家三甲医院开展科研课题。

现涵盖iPSC诱导多能干细胞，间充质干细胞、神经干细胞、血管内皮干细胞、软骨干细胞、羊膜干细胞、NK/NKT/CTL/CAR-T/CAR-NK/DC-CIK/INKT等免疫细胞；应用范围包括：疾病预防、两性生殖、神经系统疾病、脑部疾病、亚健康、免疫系统疾病、骨关节疾病等，同时可以通过个体化iPSC技术制备和分化成多种细胞，包括精原细胞、卵原细胞并形成精子/卵子。